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工具酶
2010-08-20 02:36:46 来源:不详 浏览:3154

工具酶是基因重组技术不可缺少的工具。主要有限制性内切酶、连接酶、核酸聚合酶、逆转录酶、核酸酶等。

限制性内切酶有ⅰ型和ⅱ型限制性dna内切酶之分,ⅱ型能严格识别核酸序列,并在识别区内特定的核苷酸处切开dna双链。故通常所指都是ⅱ型限制性dna内切酶。识别分四核苷酸和六核苷酸,其序列旋转对称。切口分开端和粘端,产生3′-oh和5′-p末端。内切酶品种多,使用时应注意温度、缓冲液用量(一般1μg dna/2-5单位酶)等反应条件。

连接酶有t4噬菌体dna连接酶、t4噬菌体rna连接酶、大肠埃希菌dna连接酶等。dna连接酶可连接平端,也连接粘端。反应需有mg2+和atp存在,ph7.5-7.6。最适温度37℃,30℃以下活性明显下降,但考虑到被连接dna 的稳定性和粘性末端的退火温度,一般平端连接用20-25℃,粘端连接用12℃左右。

聚合酶有dna聚合酶(以dna为模板合成dna大肠埃希菌dna聚合酶ⅰ,大肠埃希菌dna聚合酶ⅰ大片段(klenow大片段),t4或t7噬菌体dna聚合酶等);rna聚合酶(以dna为模板合成rna,t7或t3噬菌体rna聚合酶);逆转录酶(以rna为模板合成dna,除rna病毒中发现外,发现大肠埃希菌dna聚合酶ⅰ和taq dna聚合酶都有逆转录活性)。

大肠杆菌dna聚合酶ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′,3′→5′外切酶活性。klenow片段是dna聚合酶ⅰ被枯草杆菌酶作用产生的一个大片段,有5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性,无3′→5′外切酶活性。可用于缺口翻译(nick translation)法标记核酸,也可用于dna序列测定,修补dna链等。

核酸酶有dnase、rnase、核酸酶s1等,可水解相应的dna和rna,核酸酶s1可降解单链dna和rna,用量增大也可降解双链核酸。它可用于切去ds-cdna合成中产生的发夹环。

末端转移酶在mg2+存在下,选择3′-oh端单链dna为引物加成核苷酸,在co2+存在下,选择3′-oh端双链dna为引物加成核苷酸,形成多聚核苷酸尾。常用于核酸末端标记和核酸连接的互补多聚尾(连接器)。

碱性磷酸酶去除5′-p,可防止二分子dna片段5′端p基团自身空间障碍,影响dna分子之间的连接,一般用碱性磷酸酶处理载体dna除去5′端p基团,在连接酶作用下目的基因的5′端p先与载体3′端oh连接,再通过复制修复另一条链,使二条链完全连接。该方法大大提高了连接效率。

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